常见问题解答-常见问题

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一、报告原则：

推荐报告细胞核颗粒型+胞浆纤维型（AC-16）。具体滴度可稀释后报告。首次报告并没有什么注意事项，看到什么核型就报告什么核型。两种核型滴度都较高，因此都需要报告。

另外，从猴肝荧光表现看，患者血清中存在抗肝细胞膜抗原抗体，提示患者有肝损伤。抗肝细胞膜抗原抗体虽然不属于ANA共识核型，可以在报告单中备注给予临床大夫更多提示信息。

二、胞浆纤维型与癌症：

AC-16波形蛋白特点；其临床相关疾病包括SLE、RA、器官移植后患者等。有文献报道在SLE患者中研究显示，恶性肿瘤总发生率略有升高(标化发生率SIR 1.15)。常见肿瘤类型为乳腺癌、胃肠道肿瘤、血液系统肿瘤、肺癌和宫颈癌；多数患者的恶性肿瘤发生于SLE发病后8～15年^[1]。RA患者在血液、淋巴网状内皮组织肿瘤发病率有所增加^[2]。并且，针对波形蛋白的IgG和IgM自身抗体已被报道为1型神经纤维瘤和相关肿瘤患者（视神经胶质瘤和丛状神经纤维瘤）的相关标志物^[3]。

三、抗核抗体在癌症中的意义：

肿瘤细胞为活化细胞，活化细胞核抗原的改变可引起ANA生成，从癌症患者体内检出了抗核膜、核质，核仁及胞浆等多部位的自身抗体，特别是核仁和胞浆内具有与细胞生长、增殖过程密切相关的蛋白质，提示自身抗体不仅有助于鉴别诊断健康人与自身免疫患者．也有助于对健康人与癌症患者的鉴别，甚至为用自身抗体治疗肿瘤提供了理论上的可能性^[4]。

研究发现肝癌患者ANA类型主要表现为核颗粒、均质型、核仁、核膜、核点、着丝点及胞浆型^[5,6]。大细胞型神经内分泌癌主要高发胃肠道与肺部，由于发病率低、诊断困难，难以开展针对肺大细胞型神经内分泌癌（LCNEC）的相关研究，LCNEC的治疗主要参考其他非小细胞肺癌^[7]。目前未有明确肺大细胞型神经内分泌癌与抗核抗体具体核型的相关报导。针对大细胞型神经内分泌癌常见部位胃肠道，小细胞肺癌有几篇与抗核抗体荧光核型相关的文献供参考。

1. 结直肠癌:

结直肠肿瘤患者抗核抗体阳性检测率明显高于健康体检者，恶性肿瘤比良性肿瘤的抗核抗体阳性率更高，预示恶性肿瘤患者免疫功能紊乱更为严重。因此，临床检测恶性肿瘤患者的自身抗核抗体ANA能够为治疗前、治疗后、预后提供一定的依据，从而指导临床免疫治疗方案的制定^[8]。

2.胃癌和小细胞肺癌：

研究显示胃癌患者组抗核抗体阳性率为26.7%，均质型、斑点型、核仁型分别为6.7%、10.0%、10.0%，明显高于对照健康组的1%^[9]。小细胞肺癌患者检测ANA阳性率为28.79%，且抗着丝点抗体在SCLC 中检出率大于其他肿瘤患者组^[10]。

目前没有大细胞型神经内分泌癌的病例可以讨论，我们也将持续关注，及时与您沟通。

参考文献：

[1]Bernatsky s，B0ivinJ J0seph L，et a1．An international cohort study of cancer in systemic Lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum，2005，52(5)：1481—1490．

[2]刘海燕. 自身免疫性疾病与恶性肿瘤[J]. 药品评价2012,9(38):47-48.

[3]Kotaska K, Petrak B, Kukacka J, et al. Anti-vimentin antibodies and neuron-specific enolase in children with neurofibromatosis type-1. Neuro Endocrinol Lett 2007;28:761-4.

[4］武彩红，银广悦，张继领． 抗核抗体谱的检测在临床应用中的研究进展． 标记免疫分析与临床，2014，21(2):119-122．

[5] 骆思媛，张风卫等. 抗核抗体在原发性肝癌中的表达及临床意义[J]. 临床合理用药2013,6（8）：96-97.

[6] 赵海琳，闫惠平，张海萍. 83例原发性肝癌患者自身抗体检测结果分析[J]. 中国免疫学杂志2010,12(26):1127-1132.

[7] Travis WD. The 2015 WHO classification of lung tumors[J]. Pathologe,2014, 35(Suppl 2):188.

[8]杨潇，吕燕娜.免疫荧光法在结直肠肿瘤自身抗核抗体检测中的临床价值[J]. 标记免疫分析与临床 2017 ,24 (4 ):425-427.

[9].范素青，周彩莲. 间接免疫荧光法检测抗核抗体对胃癌患者病情及预后的评价价值[J]. 中国卫生检验杂志 2019 ,29 (17 ):2131-2132.

[10] 付志强，丁耀东等. 小细胞肺癌患者检测自身抗体结果分析[J]. 江西医药,2016 ,,51 (12 ):1326-1329.

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不同方法学的敏感性与特异性不同：以间接免疫法（HEp-2 IFA法）进行初筛，荧光核型为AC-29，通常可以检测到抗Scl-70抗体；但免疫印迹法对于抗Scl-70抗体检测敏感性更高。仁济医院2020年对123例ANA荧光法阴性或弱阳性（不是AC-29）但印迹法（欧蒙公司ANA谱3）抗Scl-70抗体阳性，且临床未诊断为硬皮病患者，采用ELISA法（INOVA公司）进行复查，91.1% （112/123）例阳性。因此，印迹法检测抗Scl-70抗体敏感性高于HEp-2 IFA法，而HEp-2 IFA法荧光核型为AC-29，通常抗Scl-70抗体阳性。

AC-25和AC-26同为纺锤体相关的核型，但二者形态有一些区别：在分裂期HEp-2细胞中，AC-25呈现纺锤体纤维荧光，AC-26同样呈现纺锤体纤维荧光，但分裂后期时在靠近中心粒处尤其重染，呈三角形；在分裂间期HEp-2细胞中，AC-25无明显荧光，AC-26呈现细胞核细颗粒至网状荧光。

这种现象较常见，对于这类结果差异可能的原因如下：

不同的免疫检测方法（间接免疫荧光法、免疫印迹法、酶联免疫法、免疫沉淀等）都依赖于一组已知的相关自身抗原表位（1）一般来说，自身抗体能识别线性和/或不连续的(天然的或构象的)表位。在不连续表位的情况下，许多靶抗原是大分子复合物的一部分，其中特异性的表位可能为四级结构。表位结构保存最好的免疫检测方法包括细胞裂解物的IP和HEp-2 IFA。然而，对于HEp-2 IFA值得注意的是，因为细胞已经被固定在甲醇和/或丙酮(或其他未公开的“商业秘密”固定剂)中，可能会使一些表位发生改变，并暴露其他表位。而至于WB方法，保留天然抗原表位是最大的问题，因为加热蛋白质使之变性的方式最有可能使抗原表位发生改变。事实上在蛋白质电转移到硝酸纤维素膜后，有些蛋白可能会复性/重新折叠，另外一些则很可能不会发生改变。当“印迹检出的抗体”“与IFA在HEp-2细胞中观察到的模式无关”时，一种解释是，IFA中抗原表位所识别的抗体与WB中识别的抗体并不相同，或仅代表其中的一部分(甚至是不同的部分)。抗纤维蛋白原就是一个例子。 IFA通常显示AC-9模式，但在免疫印迹中却呈阴性，因为在免疫印迹中，抗纤维蛋白抗体几乎不能识别变性的纤维蛋白。

在一个血清样本(尤其SLE患者）中通常含有一种以上的特异性自身抗体。因此，另一种解释是，同一血清中同时含有两种(或更多)完全不同的特异性抗体时，在HEp-2 IFA上观察到的是混合的结果。在这种情况下，HEp-2 IFA中可能反映了所存在的自身抗体的混合荧光模式，与所预期的血清中只有一种特异性自身抗体的模式不同。

1、Mahler M, Bluthner M, Pollard KM. Advances in B-cell epitope analysis of autoantigens in connective tissue diseases. Clin Immunol. 2003 May;107:65-79.

Date: August 14, 2020

抗Ro52抗体（也称为抗TRIM21）使用商业化的间接免疫荧光法（HEp-2 IFA）进行测定时，在HEp-2细胞上不会出现明显的荧光核型。同时，在双重免疫扩散或经典放射免疫沉淀试验中也无反应性。一种可能的解释是，这些自身抗体主要识别的是亮氨酸拉链中间结构域中的变性表位，这些表位在上述测定方法中很难获得。而与该假设相一致的是，可以在免疫印迹、ELISA、化学发光免疫分析法（CLIA）和基于粒子的免疫分析中很容易的检测到抗Ro52抗体。但是，也有报道称，在体外转译和免疫沉淀试验中，使用N末端的环指结构域在约50％的抗Ro52阳性血清中检测到了“天然” 的抗Ro52抗体（1）。在其他免疫测定中，是否因阻断了这种天然抗原表位而使抗体无法结合目前还尚不清楚。
如果抗Ro52患者样本在HEp-2 IFA中表现出了反应性，则它可能包含了针对除抗Ro52以外抗原的其他自身抗体。换句话说， HEp-2 IFA检测单一的抗Ro52 抗体样本可能出现的荧光模型应趋于阴性。
 
参考文献:
1. Buyon JP, Slade SG, Reveille JD, Hamel JC, Chan EKL. Autoantibody responses to the "native" 52-kDa SS-A/Ro protein in neonatal lupus syndromes, systemic lupus erythematosus, and Sjogren's syndrome. J Immunol. 1994 Apr 1;152:3675-84.

这个问题反映了自免实验室经常遇到的一个挑战。就目前而言，“类DFS”命名法尚未得到ICAP的认可，也未被纳入ICAP分类中。已有的证据显示，并非在所有具有核“致密”细颗粒染色和类似染色体细颗粒染色的血清中都可检测到抗DFS70自身抗体，表现出不同于抗DFS70阳性的AC-2的HEp-2 IFA核型，尽管在间期细胞和分裂期细胞染色体均有颗粒样染色，但其颗粒感与真正的AC-2存在细微差别(1,2)。抗DFS70抗体阳性的AC-2在分裂间期细胞呈不均匀颗粒样染色，有些颗粒紧密有些疏松，较大和较亮颗粒的区域与较小和较暗的颗粒区域交叉分布。在分裂期细胞染色体也是同样的染色模式。因此，一些研究人员建议使用“类DFS”一词来表示不具有AC-2荧光染色特征的血清样本模型(1、2),自身抗体标准化委员会也免费提供了具有几种不同HEp-2 IFA 核型和抗体特异性的参考血清(http://www.autoab.org/), 包括 AC-2 荧光模型的参考血清（抗DFS70 抗体阳性）(3)，这有助于AC-2荧光模型的准确识别。同时，值得注意的是抗DFS70抗体阴性的类DFS荧光核型与其特异性抗体间的临床相关性还有待进一步研究。

1.  Mahler M, Andrade LE, Casiano CA, Malyavantham K, Fritzler MJ. Anti-DFS70 antibodies: an update on our current understanding and their clinical usefulness. Expert Rev Clin Immunol. 2019;15:241-250.
2.  Infantino M, Bizzaro N, Grossi V, Manfredi M. The long-awaited 'pseudo-DFS pattern'. Expert Rev Clin Immunol. 2019 15(5):445.
3.  Dellavance A, Baldo DC, Zheng B, Mora RA, Fritzler MJ, Hiepe F, Ronnelid J, Satoh M, Garcia-De La Torre I, Wener MH, Chan EKL, Andrade LEC. Establishment of an international autoantibody reference standard for human anti-DFS70 antibodies: proof-of-concept study for a novel Megapool strategy by pooling individual specific sera. Clin Chem Lab Med. 2019;57:1754-63.

一些实验室报告荧光强度时使用数值(0,1,2,3,4)或符号(-，+，++，+++，++++)，用以表示荧光强度的半定量近似值，这可能是实际滴度的粗略近似值。许多实验室出于经济和实际操作的原因，一般只稀释到给定的稀释度(例如1:640)，当样本在1:640稀释度时仍然较亮，报告滴度≥1:640。这种方法比估计终点滴度更为合适。例如，一些样本在1:80处看起来荧光较强，但在稀释过程中变为阴性，而一些在1:80处荧光较弱的样本在稀释到1:320和1:640时荧光反而会变强。前者被称为“低稀释度抗体系统”，后者被称为“高稀释度抗体系统”。例如，抗着丝点型(AC-3)是一个典型的高稀释度抗体系统。还需要注意的是，部分样本若不进行梯度稀释，可能无法识别其真正的荧光模型。在任何情况下，如果做系列稀释，不建议报告一个给定的滴度(例如，1:1280)，最科学合理的方法是进行梯度稀释后并报告荧光强度转为阴性前的一个滴度值。

对于现代激发光源，通过简单的设置就可以增加紫外光强，这在HEp-2间接免疫荧光法(HEp-2 IFA)中对ANA阳性的判断影响较大。对于老旧的显微镜，可通过更换新的紫外灯泡来增加紫外光强。HEp-2 IFA的推荐放大倍数为x400 (x40物镜)，较低的放大倍数会导致弱阳性样本被判读为阴性。

因此，每个实验室都应该建立一套含有阳性和阴性人血清的质控样本，以设置最合适的光源。针对HEp-2 IFA阴性样本的选择，首先应使用特定的试剂和显微镜确定HEp-2 IFA在当地人群中的cutoff值。在临床日常检测中，HEp-2 IFA阴性血清的范围应为完全阴性到临界值阳性。后者可能最适合作为光强度设置的参考参数。此外，需考虑荧光素标记的二抗。因为全球范围内显微镜设置的可变性，HEp-2 IFA试剂盒内提供的可直接使用的荧光二抗很难满足所有客户。因此，应以棋盘实验方式通过已知的阴性和弱阳性样本滴定荧光二抗确定其使用浓度。

核膜型(AC-11和AC-12)在间期细胞核边缘会呈现特异性染色，但分裂期细胞由于核膜分解不会呈现该染色模型。此外，单个间期细胞核上可能染色较弱，但在两个间期细胞的核边缘交汇处荧光则会增强。除了AC-11和AC-12相关的自身靶抗原外，不确定是否有其它的自身抗原是位于HEp-2细胞核的外周。有时也会有一些样本产生核均质型染色(AC-1)，并在核膜附近稍有增强。根据经验，当使用不同品牌或同一品牌不同批次的HEp-2载片测试样本时，并不能始终观察到这一现象。这就表明，这种特殊的荧光模型可能是细胞培养和固定条件等人为因素造成的假象，另一种可能性是在IFA实验的孵育步骤中由于细胞基质的意外干燥而造成的。

许多经典的HEp-2试剂盒带有异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的山羊抗人IgG偶联物，对于IFA双染色法，需要一个配备有适合多色成像的激发器和屏障过滤器的荧光显微镜，此外，要有针对于特定亚细胞结构域特异性蛋白的单克隆或多克隆抗体，该动物抗体将成为亚细胞结构域的示踪剂。以核仁为例，需要一种针对核仁蛋白 (如纤维蛋白、核仁磷蛋白B23等) 的抗体，如市售的小鼠单克隆抗核仁纤维蛋白IgG抗体。然后使用红色染料(如罗丹明或Alexa586)标记山羊抗小鼠IgG，以区别于FITC染色的人类抗核仁抗体。重点在于标记IgG抗体的荧光素要与FITC不同，并与用于FITC酶标记物的激发/发射/阻挡滤光光谱中的光信号不重叠。然后，将在HEp-2载片同孔中孵育人抗体和小鼠单克隆抗原纤维蛋白抗体，两者均应进行稀释以获得良好的荧光信号。

对于间接免疫荧光双重染色法，一抗孵育步骤有三种方法：

1)人源抗体==>洗涤(避免孔干燥)=>加入小鼠单克隆抗体==>洗涤==>加入适当比例稀释后的两种二抗结合物的混合物==>洗涤==>固定介质(如甘油)和盖玻片。

2)小鼠单克隆抗体==>洗涤==>加入人源抗体==>洗涤==>加入适当比例稀释后的两种二抗结合物的混合物==>洗涤==>固定介质和盖玻片

3)将小鼠单克隆抗体和人源抗体混合，考虑到两者混合在一起相当于各稀释了一倍==>洗涤 ==>加入适当比例稀释后的两种二抗结合物的混合物==> 洗涤 ==>固定介质和盖玻片

在一些实验方案中，使用DAPI(蓝色染料)进行复染通常是有帮助的。选择以上哪一种方案取决于使用的具体抗体。如果一种方法不奏效，可以尝试其他方法。

最后在显微镜下的每种荧光团的滤光片下会看到相同的视野，拍摄同一视场野的高分辨率照片，然后根据需要使用图像处理程序（如 Adobe PhotoShop）处理重叠图像，进而确定血清样本中的一抗是否与单克隆抗体具有相同的亚细胞结构域。

ICAP委员会对此问题进行了广泛的讨论，但迄今尚未达成共识。在许多国家/地区，仅显示细胞胞浆染色的血清被认为是ANA阳性，而在另一部分国家/地区，这种血清被认为是ANA阴性，但胞浆阳性。而有些地区胞浆染色通常又是不报告的，因为它不能严格地定义为核染色。

但是，广泛认为，仅胞浆染色的血清不应被忽略（1），部分学者建议将ANA（抗核抗体）检测重命名为anti-cellular antibodies（抗细胞抗体）检测（1），这与ICAP的IFA模型命名法一致（即AC =anti-cellular）。这种情况如何进行报告目前仍是一个问题。且将其确定为ANA阳性还是阴性对某些疾病分类标准是存在影响的，ICAP也正在努力在未来达成共识建议。

N. Agmon-Levin, J. Damoiseaux, C. Kallenberg, U. Sack, T. Witte, M. Herold, X. Bossuyt, L. Musset, R. Cervera, A. Plaza- Lopez, C. Dias, Sousa M. Jose, A. Radice, C. Eriksson, O. Hultgren, M. Viander, M. Khamashta, S. Regenass, L. E. Coelho Andrade, A. Wiik, A. Tincani, J. Ronnelid, D. B. Bloch, M. J. Fritzler, E. K. Chan, I. Garcia-de la Torre, K. N. Konstantinov, R. Lahita, M. Wilson, O. Vainio, N. Fabien, R. A. Sinico, P. Meroni, and Y. Shoenfeld. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann.Rheum.Dis. 73:17-23, 2014.

使用不同制造商的HEp-2细胞载片，HEp-2免疫荧光法(IFA)的染色可能存在明显的差异，在某些细胞基质中可能缺失某些自身抗原和抗原决定簇。为确保所使用的HEp-2载片能够检测出抗SS-A/Ro60抗体和抗SS-B/La抗体的荧光模型，应使用合适的参考材料(如www.AutoAb.org)来验证HEp-2载片和所使用的其他试剂的性能。同时建议采用低滴度阳性对照，以测试每批HEp-2载片的敏感性。如果抗SS-A/Ro60抗体和抗SS-B/La抗体的标准品未呈现细胞核染色，则表明该试剂没有针对这些自身抗原进行优化。特别是SS-A/Ro60自身抗原，比较不稳定，可以用温和的溶剂提取，甚至长时间保存在某些缓冲液中。

抗SS-B/La抗体：通常经固相法(SPA)测定的高滴度抗SS-B/La抗体阳性血清在HEp-2 IFA中亦呈现阳性。但是，单独抗SS-B/La抗体阳性的血清非常罕见，因此任何HEp-2 IFA染色阳性都提示除抗SS-B/La抗体可能与第二抗体（例如抗SS-A/Ro60）有关。

抗Ro60/SS-A抗体：有报道称，固相法测定的抗SS-A/Ro60抗体阳性血清经HEp-2 IFA检测可能为阴性。抗SS-A/Ro60抗体通常会产生核细颗粒荧光模型AC-4，但某些制造商提供的HEp-2载片中，抗SS-A/Ro60抗体可能为阴性。据报道，有制造商提供的表达SS-A/Ro60抗原的HEp-2细胞载片，与传统的HEp-2基质比较具有更高的敏感性和特异性。相比之下，Ro52 (TRIM21)自身抗体在HEp-2 IFA检测中较为罕见。因此，HEp-2 IFA检测单一的抗Ro52 /TRIM21抗体血清可能出现阴性的荧光模型。

如果间接免疫荧光法检测HEp-2细胞(HEp-2 IFA)在1:80时呈阳性，建议将血清滴度稀释到至少1:640，然后报告滴度为：

•>1:80 - <1:640

•= 1:640

•> 1:640

建议将稀释1:640作为最低要求。考虑到检测成本，一些实验室稀释度不超过1:640，另一些实验室使用自动化的ANA IFA技术将经计算获得最终滴度。

补充说明:

虽然对某些抗体而言，较高的滴度更能提示自身抗体相关的风湿病(AARD)，但仅用HEp-2 IFA方法判读时仍需注意:

1. ICAP所描述的HEp-2 IFA (ANA)荧光模型并未包括所有模型。例如核致密细颗粒型(AC-2)，已被证明在一般人群中可以出现高滴度抗体(1)，且高尔基体、中心体和其他一些细胞胞浆模型也是如此，但仍需进一步验证。

2. 在某个时间点上ANA本身意义并不大，重要的是要知道滴度随时间的变化是减少、增加还是保持不变。

参考文献:

1. Mariz HA, Sato EI, Barbosa SH, Rodrigues SH, Dellavance A, Andrade LE. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 2011;63:191-200.
   

首先，有必要对显微镜设置和HEp-2载片进行评估，以确定是否有能力呈现ICAP描述的AC-29模型，AC-29模型的一些评估要素可能不容易识别。虽然分裂间期细胞核以及分裂期细胞染色体的荧光模型非常明显，但核仁组织区(NOR)、核仁和细胞质染色需要辨别。对于NOR染色，需要缓慢上下调节显微镜的微调旋钮来分析不同的视野。血清在低倍稀释时，细胞质染色可能不容易观察到，只有在高倍稀释时才可见。根据HEp-2载片品牌/批号和制造商的不同，核仁的染色可能不完全一致，会存在较大差异。

使用抗Topo I的参考血清（来自自身抗体标准化委员会（ASC）CAT#: IS2135，ANA #09），五种亚细胞结构域的荧光模型应该能够全部被识别。若不能识别，建议调整显微镜设置、HEp-2载片和/或使用相关试剂来排除异常。

如果五个评估要素均被识别，则为典型的抗Topo I抗体的AC-29模型。如果仅未观察到核仁染色，仍然可以将其归类为AC-29模型。若采用ASC提供的标准血清以及其他抗Topo I的内部质控品，其他四个评估要素中任何一项未被识别，则不能判断为AC-29模型。

最后，由于AC-29模型需要在不同对焦视野上进行观察，对于数值孔径较小、景深较浅的自动化IFA显微系统来说，AC-29模型的识别可能存在困难。

NuMA核型对应的靶抗原为NuMA蛋白，又称为NuMA-1蛋白，目前无商品化检测试剂盒。NuMA核型通常我们检测的抗核抗体谱均为阴性，但抗NuMA抗体最常伴随的ENA为SSA。

大约一半的NuMA核型患者具有系统性自身免疫性风湿疾病的临床特征，其中就包括干燥综合征，因此这两例病例出现SSA/SSB阳性，属于正常现象。NuMA核型对应的靶抗原为NuMA蛋白，又称为NuMA-1蛋白，目前无商品化检测试剂盒。NuMA核型通常我们检测的抗核抗体谱均为阴性，但抗NuMA抗体最常伴随的ENA为SSA。

大约一半的NuMA核型患者具有系统性自身免疫性风湿疾病的临床特征，其中就包括干燥综合征，因此这两例病例出现SSA/SSB阳性，属于正常现象。NuMA核型对应的靶抗原为NuMA蛋白，又称为NuMA-1蛋白，目前无商品化检测试剂盒。NuMA核型通常我们检测的抗核抗体谱均为阴性，但抗NuMA抗体最常伴随的ENA为SSA。

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