这是个有趣的问题，也反映出了ANA实验室常遇到的一个难题。目前，“类DFS”这一命名尚未得到ICAP认可，也未包含在ICAP分类中。但有证据表明，并非所有具有核“致密”细颗粒荧光核型或类似染色质染色荧光核型血清中都可检测到抗DFS70自身抗体。虽然分裂间期细胞核与分裂期染色体中呈现颗粒结构染色，但其颗粒结构与真正的AC-2荧光核型略有不同，可能反应的是一种有别于抗DFS70阳性的AC-2荧光核型[1, 2]。抗DFS70阳性的AC-2荧光核型在细胞核中呈现不均匀的颗粒结构，较致密的颗粒区域与较稀疏的区域相邻、较大较亮颗粒区域与较小较暗颗粒区域相穿插，分裂期染色体中也有同样表现。因此一些研究人员建议使用“类DFS”一词来指代不具有明确AC-2染色特征的血清荧光核型[1, 2]。自身抗体标准化委员会可免费提供具有不同HEp-2 IFA荧光核型及抗体特异性的参考血清(http://www.autoab.org/)，其中包括AC-2荧光核型（DFS70有反应性）的参考血清[3]，有助于准确识别AC-2荧光核型。此外需要注意，抗DFS70阴性的类DFS荧光核型与对应的特异性自身抗体靶抗原间的临床相关性仍有待研究。

1. Mahler M, Andrade LE, Casiano CA, Malyavantham K, Fritzler MJ. Anti-DFS70 antibodies: an update on our current understanding and their clinical usefulness. Expert Rev Clin Immunol. 2019;15:241-250.
2. Infantino M, Bizzaro N, Grossi V, Manfredi M. The long-awaited 'pseudo-DFS pattern'. Expert Rev Clin Immunol. 2019 15(5):445.
3. Dellavance A, Baldo DC, Zheng B, Mora RA, Fritzler MJ, Hiepe F, Ronnelid J, Satoh M, Garcia-De La Torre I, Wener MH, Chan EKL, Andrade LEC. Establishment of an international autoantibody reference standard for human anti-DFS70 antibodies: proof-of-concept study for a novel Megapool strategy by pooling individual specific sera. Clin Chem Lab Med. 2019;57:1754-63.

有些实验室用数字（0，1，2，3，4）或符号（-，+，++，+++，++++），以半定量形式报告荧光强度，相对于实际滴度来讲这可能只是个粗略的近似值。出于经济和现实原因，很多实验室只稀释到特定稀释度（如1/640），如样本在1/640仍明亮，则滴度报告为＞1/640，相比于“瞎猜”终点滴度，更建议采用这种方法，因为数值或符号系统与实际滴定之间暂无明确相关性。例如有些样品在1/80稀释度时看上去非常亮，但滴定过程中很快就变为阴性，而有些在1/80稀释度时不怎么亮的样本滴定到1/320和1/640时可能会变得更亮，前者称为“低稀释系统”，后者称为“高稀释系统”。比如抗着丝点（AC-3）通常是高稀释系统，如不经稀释可能无法识别出真正的ANA荧光核型。任何情况下如果没有进行实际的滴定过程，不建议报告特定滴度（如1/1280）。最科学合理的方法是实际进行滴度测定，并报告阴性滴度的上一个滴度。

在HEp-2间接免疫荧光检测法（HEp-2 IFA）中，需要非常注意紫外光强度对ANA阳性的影响，现代紫外线光源通过简单设置即可实现紫外光强增加，较旧的显微镜则通常需要更换灯泡。而如本问题所示，任何光源强度的增加都会影响对HEp-2 IFA阳性的判读。另外HEp-2 IFA推荐的放大倍数为x400（x40物镜），放大倍数偏低会导致低强度阳性样本被判为阴性。

为确保光源设置合适，每个实验室都应有一套阳性和阴性的人血清样本作对照。在此简要讨论关于阴性HEp-2 IFA样本的选择：应使用特定试剂及显微镜设置，确定当地人群中HEp-2 IFA的cut-off。临床实验室应具有包括从几乎完全阴性到临界阳性的HEp-2 IFA阴性血清，而后者也许最适合作为设置光强度的参考控制品 。此外还需考虑荧光二抗，鉴于显微镜设置差异，HEp-2载片试剂中提供的即用型二抗并不能适用于所有客户，因此以已知的阴性和低强度阳性样品确定二抗浓度是较为明智的选择。

核膜型（AC-11和AC-12）会在分裂间期细胞的细胞核周围边界处呈现独特染色，同时由于分裂期核膜破裂，分裂期细胞中没有染色。有时分裂间期的细胞核上可能有微弱染色，为核膜染色叠加所致。除AC-11和AC-12代表的靶抗原外，尚无其他已知的仅位于HEp-2细胞核外周的自身抗原。偶尔有某些样本会呈现核均质染色（AC-1），在核膜附近略有增强，根据我们的经验，使用其他品牌或同品牌不同批次的HEp-2玻片再次检测不会观察到该现象。因此这种特定的荧光分布可能是由细胞培养及固定条件产生的伪影。另外也可能是在IFA操作的孵育期间，细胞基质意外干燥引起的伪影。

许多典型的HEp-2试剂盒都带有异硫氰酸荧光素(FITC)偶联物，如山羊抗人IgG。对于双免疫荧光IFA方法，您需要配备适合多色成像的激发器和波谱滤光片的荧光显微镜。此外，需要针对您感兴趣的亚细胞结构特异性蛋白质的单克隆或多克隆抗体。这种动物抗体将成为亚细胞结构域的示踪剂。如果我们以核仁为例，那么你需要一种针对核仁蛋白的抗体(例如，纤维蛋白，核仁磷酸化蛋白B23等)。假设你可以获得市售的小鼠单克隆抗纤维蛋白IgG抗体。普遍的做法是用红色荧光染料(例如罗丹明或Alexa586)偶联的山羊抗小鼠IgG，以将其与FITC染色的人抗核仁抗体区分开来。并且重要的是针对小鼠IgG的荧光染料与FITC不同，并且需要与用于FITC的激发/发射/阻挡滤光光谱中的光信号不重叠。在这个过程中，建议先用单克隆抗体稀释度优化反应，能够保证两者的稀释度都应能产生良好的荧光信号。同一个HEp-2反应体系中，你将培养人类抗体和小鼠单克隆抗纤维蛋白抗体。
对于双重荧光免疫方案，一抗孵育步骤有三种选择:
1)人抗体孵育==> 清洗(不要让细胞基质干)==> 应用小鼠单克隆孵育==> 清洗==> 加入将两种按适当的稀释度和比例混合后偶联二抗==> 清洗==> 滴入介质(如缓冲甘油)和盖片。
2)鼠单抗孵育==> 清洗(不要让细胞基质干)==> 应用人抗体孵育==> 清洗==> 加入将两种按适当的稀释度和比例混合后偶联二抗==> 清洗==> 滴入介质(如缓冲甘油)和盖片。
3)混合小鼠单克隆抗体和人抗体，需考虑到两者的稀释度现在减少了一半==> 清洗==> 加入将两种按适当的稀释度和比例混合后偶联二抗==> 清洗==> 滴入介质(如缓冲甘油)和盖片。

在一些方案中，通常使用DAPI(蓝色染色)进行衬染是有帮助的，可能对于以上3个选项中的可能重要，也可能不重要。可能其中一种比另一种效果更好，这取决于你将使用的特定抗体。如果一种方法不起作用，尝试其他的两个方法。
然后，您将能够在同一个视野下看到每个荧光基团，你就可以分辨人抗体是否与单克隆抗体染色相同的亚细胞结构域。这对于拍摄相同视场下的高分辨率照片，然后根据需要使用Adobe PhotoShop等图像处理程序将图像重叠，显然是一个优势。

这是ICAP委员会广泛讨论的问题，但迄今尚未达成共识。在许多国家，仅显示细胞质染色的血清被认为是ANA检测阳性，而在其他国家，这类血清被认为是ANA阴性但细胞质阳性。在其他一下区域，细胞质染色根本没有报道，因为它不能严格定义为核染色。人们普遍认为，单独进行细胞质染色的血清不应被忽视(1)。关于该主题的其他讨论建议将ANA测试重命名为抗细胞抗体(1)，这与ICAP为各种荧光模式(即AC =抗细胞)选择的命名法一致。如何报道这种情况是一个本地问题。然而，是否确定为ANA阳性或阴性对某些疾病分类标准有影响。ICAP正努力在未来一年达成共识。

N. Agmon-Levin, J. Damoiseaux, C. Kallenberg, U. Sack, T. Witte, M. Herold, X. Bossuyt, L. Musset, R. Cervera, A. Plaza- Lopez, C. Dias, Sousa M. Jose, A. Radice, C. Eriksson, O. Hultgren, M. Viander, M. Khamashta, S. Regenass, L. E. Coelho Andrade, A. Wiik, A. Tincani, J. Ronnelid, D. B. Bloch, M. J. Fritzler, E. K. Chan, I. Garcia-de la Torre, K. N. Konstantinov, R. Lahita, M. Wilson, O. Vainio, N. Fabien, R. A. Sinico, P. Meroni, and Y. Shoenfeld. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann.Rheum.Dis. 73:17-23, 2014.

HEp-2免疫荧光法(IFA)染色可能有一些显著的差异，这取决于HEp-2细胞载玻片的制造商。一些自身抗原和表位在某些细胞制剂中可能不可用。为了确保所使用的HEp-2载玻片能够检测抗ro60 /SS-A和抗la /SS-B染色，应使用合适的参考材料，如www.AutoAb.org的参考品来验证HEp-2载玻片和实验中使用的其他试剂。该领域的专家还建议使用低滴度阳性对照来测试每批HEp-2载玻片，以获得适当的灵敏度。如果明确定义的抗ro60 /SSA和抗la /SS-B标准没有显示核染色，这清楚地表明IFA尚未针对这些自身抗原进行优化。特别是Ro60自身抗原，似乎是不稳定的，可以用温和的溶剂提取和长时间暴露于一些缓冲液中。

Anti-La/SS-B -一般来说，通过固相测定(SPA)确定的高滴度阳性Anti-La/SS-B血清在HEp-2 IFA中很大可能呈阳性。高滴度抗la /SS-B血清不太可能在HEp-2细胞染色中呈阴性。需要注意的是，单特异性抗la /SS-B血清非常罕见，因此IFA阳性染色都可能与第二抗体有关如抗ro60 /SS-A。

Anti-Ro60/SS-A -有报道称SPA阳性的Anti-Ro60/SS-A血清可能HEp-2 IFA阴性。Anti-Ro60/SS-A通常呈AC-4核斑点染色，但在某些市售HEp-2载玻片中，Anti-Ro60/SS-A可能呈阴性。一家生产商提供高表达Ro60/SS-A抗原的HEp-2细胞载玻片，据报道，这种底物比传统HEp-2底物检测这种抗体具有更高的敏感性和特异性。相反，Ro52 (TRIM21)自身抗体在HEp-2 IFA试验中不能被常规识别。因此，单特异性抗ro52 /TRIM21血清HEp-2 IFA可能完全阴性。

如果HEp-2细胞的间接免疫荧光试验(HEp-2 IFA)为1/80阳性，则建议将血清滴度稀释至至少1/640，此后报告应表明滴度是否为1/640

>1/80 <1/640
= 1/640
>1/640
建议稀释1/640作为最低要求。出于后勤和预算考虑，一些实验室不会稀释超过1/640，而其他使用自动化ANA IFA技术的实验室将获得数字计算的终点滴度结果。

其他说明:
虽然对于某些抗体，较高的滴度可能更能表明自身抗体相关的风湿病(AARD)，但仅考虑HEp-2 IFA方法时需要注意:
但ICAP所描述的HEp-2 IFA (ANA)模式的全谱并非全部如此。最明显的例子是核致密细斑型(AC-2型)，它已被证明在普通人群中以高滴度出现(1)，但非受控或者未经验证的经验表明，高尔基体、中心体和其他细胞质型也是如此。
一个时间点的ANA本身并不能说明什么。更重要的是要知道，随着时间的推移，滴度是在下降、增加还是保持不变。

参考文献:

Mariz HA, Sato EI, Barbosa SH, Rodrigues SH, Dellavance A, Andrade LE. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 2011;63:191-200.

非常重要的一点是显微镜设置和HEp-2载玻片是否具有评估显示 ICAP分类树中AC-29 核型的能力，AC-29的一些元素模式并不能很容易的被识别。在核染色的同时且中期板非常明显，核仁组织区域 （NOR）、核仁和细胞质需要解释。对于 NOR染色，重要的是通过缓慢分析不同的焦距水平 上下调整显微镜上的千分尺旋钮。细胞质在较低的血清稀释度下染色可能不容易看到，可能在更高的稀释度才比较明显 。由于HEp-2载玻片品牌/批次和 厂牌间变量导致核仁的染色可能更加不一致。

使用来自自身抗体标准化委员会（ASC） 抗TOPO-I的标准抗体（CAT#：IS2135。ANA#09） ，应该能够识别所有五个亚细胞区域。否则，应考虑进行问题排除，如：调整显微镜设置、使用的HEp-2载玻片和/或试剂。

如果能够确定AC29所有五个元素，那么AC-29模式用于确定抗Topo I的特异性则会更加确定。如果观察到只有核仁没有被染色，仍然可以将其分类为AC-29。缺少其他四种元素中的任何一种都与AC-29模式不兼容，前提是实验室能够使用ASC或其他抗TOPO-I内部标准常规观察到这五种元素。

最后，因为 AC-29 模式识别需要在不同焦平面上检查。所以AC-29 是对于数值孔径较低的自动化IFA显微系统来说可能是一个问题。

老师您好：

本例核型核型AC4+20
结果报告均以HEp2所观察到的核型为准。猴肝在一些特殊核型中(核仁，核点，核膜，着丝点)有比较明显的提示作用，核仁核型可能混有其他核内干扰核型，建议梯度稀释一下看一下，如果梯度稀释也没有核仁表现，以HEp2 核型报告相应核型。